Inventaire et développement d’un outil performant de PCR pour la détermination des complexes clonaux de souches de Listeria monocytogenes isolées dans la filière des produits de la pêche et de l’aquaculture
Résumé du projet
De nouvelles techniques de typage se sont développées ces dernières années pour pouvoir discriminer rapidement les souches de Listeria monocytogenes isolées de patients ou d’aliments. Celle de référence a longtemps été la PFGE (électrophorèse en champ pulsé) du fait de son fort pouvoir discriminant. Le projet TYLPM a utilisé une nouvelle méthode de séquençage génomique Multi-locus sequence typing (MLST), qui est développée pour augmenter les capacités d’identification des sources de contamination et elle permet l’identification de complexes clonaux (CC) de L. monocytogenes.
Un inventaire des CCs présents dans la filière aquatique (correspondance entre les CCs et les profils obtenus par PFGE) a été réalisé sur un panel de 704 souches sélectionnées dans une souchothèque pour visualiser la diversité génétique circulant dans celle-ci. En parallèle, ce projet a permis d’optimiser une nouvelle méthode rapide d’identification des CCs de L. monocytogenes par PCR en temps réel. Enfin, le risque représenté par ce pathogène dans la filière selon le degré de virulence des CCs a été évalué, ce qui permettra aux professionnels d’être encore plus proactifs dans leur combat contre cette bactérie pathogène.
Contexte
Comme relevé par l’Organisation des Nations Unies pour l’alimentation et l’agriculture (FAO), la production mondiale de produits aquatiques continue à progresser ce qui suit la progression de la consommation humaine mondiale en produits aquatiques. En 2017, en Europe, la listériose, maladie due à la bactérie pathogène Listeria monocytogenes, se situent au 5ème rang en nombre de cas mais au 1er rang en nombre de décès avec un taux de mortalité de 13,8 %. En France plus de quinze toxi-infections alimentaires collectives (TIAC) ont été associées à des produits de la mer sur les 30 dernières années (Bourdin, 2009).
En Europe, des TIAC liées à la consommation de produits de la mer ont été régulièrement reportées : entre 2007 et 2010 suite à la consommation de chaire de crabe (Nielsen et al., 2017), entre 2013 et 2015 suite à la consommation de poisson fumé au Danemark (Gillesberg Lassen et al., 2016), entre 2015 et 2017 suite à la consommation de poisson fumé au Danemark et en France (Schjørring et al., 2017), en 2018 dans plusieurs pays Européens suite à la consommation de poisson fumé produit en Pologne (EFSA, 2018) et entre 2018 et 2019 liée à la consommation de poisson mariné en Norvège (FSN, 2019). Au premier semestre 2020, aux Pays-Bas, six personnes ont été hospitalisées avec deux décès suite à la consommation de filets de truite fumée et une autre personne décédée mais sans information sur les causes du décès (Whitworth, 2020). Au second semestre 2020, deux cas de listérioses déclarés en Autriche ont été ensuite raccordés à d’autres cas au Danemark (1 cas) et en Allemagne (30 cas) (Rasff, 2020, Whitworth, 2020).
La méthode de référence de caractérisation des souches de L. monocytogenes lors d’épidémies et pour les entreprises a longtemps été la PFGE (électrophorèse en champ pulsé) du fait de son fort pouvoir discriminant et de la possibilité d’échanger des profils entre laboratoires. Cette méthode ne permet pas de structurer les populations du point de vue de leur phylogénie car elle ne permet pas de définir le lien génétique entre des souches ayant des profils PFGE différents. Depuis 2008, la méthode de MLST a été largement utilisée pour apporter une meilleure compréhension de la phylogénétique des souches. Cette méthode permet de comparer la distribution des CCs au niveau international sur la base d’une nomenclature uniforme et des bases de données librement accessibles via internet (https://bigsdb.pasteur.fr/listeria/listeria.html).
Plusieurs études ont porté sur le typage d’isolats de L. monocytogenes par MLST et en parallèle typées par la méthode PFGE ce qui permet de faire des corrélations entre les deux types de données (Maury et al., 2016, Félix et al., 2018). Les CC1, CC2, CC4, et CC6, qui ont été définis comme hyper-virulents, ont été fortement associés à des origines cliniques plutôt pour les infections du système nerveux et pour le fœtus alors que les CC9 et CC121, qui ont été déterminés comme hypo-virulents, ont été associés avec les patients ayant un système immunitaire déficient (Maury et al., 2016). Dans la filière des produits de la pêche, le CC121 est prédominant dans une proportion plus importante que dans les autres filières (Nielsen et al., 2017, Félix et al., 2018). Toutefois toutes les épidémies reportées impliquant des produits de la pêche ont été liées à d’autres CCs comme les CC1 (Nielsen et al., 2017), CC89 (Lassen et al., 2016), CC8 (Lassen et al., 2016, Schjørring et al., 2017, EFSA, 2019).
Objectifs
- Réaliser un inventaire de la diversité génétique par complexes clonaux sur la base des profils PFGE obtenus sur les isolats de L. monocytogenes présents dans la souchothèque créée et constituée à la suite de programmes de recherche réalisés avec les professionnels de la filière
- Développer/ optimiser un outil de PCR innovant et rapide pour la détection d’au moins 28 complexes clonaux (CCs) représentant plus de 95% de la diversité génétique observée dans la filière. Cette PCR en temps réel inclura des sous-groupes génétiques au sein des CCs les plus prévalent dans la filière pêche comme le CC121
Méthodologie
Nous avons identifié les CCs de 704 souches de L. monocytogenes sélectionnées dans la souchothèque du LSAl site de Boulogne sur mer isolées créée et mise à jour lors de projets de recherche réalisés avec les professionnels de la filière saumon et truite. Le panel des souches sélectionnées comprenait 704 souches isolées d’entreprises françaises de transformation de truites et saumons durant des projets de recherche. Cette sélection a été basée pour obtenir un maximum de diversité génétique sur plusieurs années, dans diverses natures de prélèvements et diverses entreprises.
Ensuite, un « mapping » a été effectué entre les profils PFGE des souches et une base de donnée de profils PFGE de CCs de L. monocytogenes connus. Pour les souches dont les CCs n’ont pas pu être déterminé par la technique de « mapping », ces dernières ont été analysées par la PCR en temps réel GENOListeria (optimisée dans ce projet) ou par séquençage du génome (whole genome MLST).
Résultats
Le panel des souches sélectionnées comprenait 704 souches isolées d’entreprises françaises de transformation de truites et saumons durant des projets de recherche. Les souches sélectionnées étaient principalement de la lignée II, sérogroupe IIa et sérotype 1 /2a. Vingt-neuf pulsotypes ont été identifiés pour les 704 souches. Plusieurs profils étaient assez proches les uns des autres. Suite au « mapping » PFGE, les CCs de 541 souches ont pu être déterminés. Pour 157 souches, le « mapping PFGE » n’a pas permis d’identifier les CCs. Ces derniers ont été identifiés par la PCR en temps réel GenoListeria optimisée dans ce projet.
La méthode de PCR en temps réel GenoListeria est basée sur l’identification par PCR en réel Taqman® de régions génomiques spécifiques et sensibles de 29 complexes clonaux (CCs) de Listeria monocytogenes. Cette méthode a été élaborée en se basant sur les génomes complets de 3167 souches. Pour identifier ces 29 CC, 30 couples de sondes et d’amorces ont été définis. Elles sont complétées par 6 autres couples de sondes et amorces, utilisées comme contrôles, permettant de définir les sérotypes moléculaires des souches. Enfin, 93% (659/704) des souches du panel de L. monocytogenes étudiée appartiennent aux trois CCs suivants : CC121 (435 souches), CC26 (155 souches) et CC204 (65 souches) qui sont des CCs déjà décrits dans la littérature comme associés à la production alimentaire.
L’identification, pour quelques souches, des CC1 et CC6 qui sont décrits dans la littérature comme pouvant être hyper-virulent et du CC9 qui pourrait être plus responsable de cas sporadiques de listérioses sont des informations à prendre en compte par les entreprises mais le lien entre la génétique d’une souche et la virulence n’est pas toujours avéré comme cela a été démontré dans la littérature. Par contre, deux CCs non décrit dans la filière des produits de la pêche, CC 54 et CC191, ont été identifiés dans le panel de souches sélectionnées. L’identification des CCs permet une bonne cartographie des voies de contamination dans des environnements/ aliments et les liens possibles lors de TIAC entre les cas humains et l’aliment et/ ou l’entreprise contaminés.
Perspectives
Des projets sont en cours pour ajouter de nouveaux tests PCR au 36 existants, notamment les gènes identifiés dans la résistance aux biocides ou la croissance au froid par exemple.
La méthode de PCR en temps réel GenoListeria pourrait être appliquée pour une détection direct sur des extraits d’ADN plus complexes que l’extrait d’ADN de souches pures. Cette application nécessite des tests plus poussés mais est rendu possible par l’absence de détection croisées par les tests de PCR qui permet la détection simultanée des plusieurs CCs dans un même échantillon.
La détermination des CCs présent dans la filière et/ ou dans les entreprises devra être étendue pour permettre de faire des cartographies des voies de contamination en entreprise. Il serait intéressant de refaire des états des lieux plus récents des entreprises de la filière et de comparer les CCs récents avec ceux de cette étude pour faire une cartographie sur plusieurs années des ateliers. Cela permettra également de déterminer si des souches sont persistantes et de les étudier ensuite plus spécifiquement avec une approche génétique (gènes de résistance, marqueur de persistance, de biofilm, virulence…) et une approche phénotypique (biofim, test in vitro virulence).
Thématique du projet
QHSE
Statut du projet
Terminé : 01/10/2019 - 28/02/2021
Porteur du projet

Partenaire

Financeur
